昆明理工大学季维智团队Science背靠背揭示体外培养的灵长类动物早期胚胎发育图谱

编者按
哺乳动物的胚胎如何从一个受精卵逐步发育成为个体一直以来都是发育生物学的核心问题。由于样品稀缺以及伦理的限制，对人源受精卵着床后体内胚胎发育的研究存在相当大的困难，而对于非人灵长类动物来说也难以展开。2016年，来自剑桥大学和洛克菲勒大学的团队先后在Nature和NCB上发表文章在体外建立了人类囊胚体外培养模拟着床体系，突破的相关研究的技术瓶颈。今年8月份，北大汤富酬团队与乔杰团队合作结合多层组学技术，解析了围着床期人胚胎发育的分子调控机制。然而由于14天规则的限制，来源于人类的研究工作受限于受精后14天，那么在这之后胚胎发育早期的一些重要科学问题仍然有待回答，因而食蟹猴就成为了比较理想的研究对象。今日，Science杂志上背靠背发表了由国内多个研究团队合作完成的两篇研究论文，首次证明了灵长类动物胚胎可以在体外发育至原肠运动期，在体外重现了灵长类动物早期胚胎发育的重要生物学事件，具有重要意义。有鉴于此，BioArt特别邀请到了同济大学高绍荣教授和北京大学汤富酬教授对上述工作进行了点评，以飨读者！

点评 | 高绍荣（同济大学）、周帆、汤富酬（北京大学）

 

近几十年来随着体外受精及胚胎培养技术的进步，对于灵长类着床前胚胎的研究取得了巨大的发展。回答了诸如细胞多能性获得、细胞谱系分化等基础科学问题。尽管取得了巨大的进步，对于灵长类着床后胚胎的多能性退出、细胞三胚层谱系分化以及胚胎形态发生等许多问题仍未解决。由于取材及伦理的限制，对于人着床后胚胎发育的研究几乎不可想象。虽然灵长类动物早期胚胎发育与人高度相似，但对于灵长类动物着床后胚胎发育的研究依然难以开展，人力物力花费巨大【1】，领域的进一步发展亟待创新性的技术突破。2016年英国剑桥及美国洛克菲勒大学科学家Magdalena Zernicka-Goetz和Ali H. Brivanlou共同建立胚胎体外延迟培养技术，突破了研究瓶颈【2,3】。今年8月份，北京大学汤富酬教授和北京大学第三医院乔杰教授实验室运用这一技术，结合单细胞多组学技术，揭示了人早期着床后胚胎发育的基因表达调控网络和DNA甲基化动态变化规律，解析了围着床期人胚胎发育的分子调控机制（Nature | 汤富酬/乔杰合作利用单细胞转录组和DNA甲基化组图谱重构人类胚胎着床过程）【4】。由于14天规则的限制，上述工作停止于受精后14天，诸如三胚层分化、细胞间互做、原始生殖细胞特化等许多科学问题尚未回答。而这些问题又是业界关心及重要的基础科学问题。

为了深入探索灵长类胚胎着床后发育过程中的分子机制，2019年11月1日，昆明理工大学灵长类转化医学研究院季维智院士团队谭韬、牛昱宇课题组与美国索尔克研究所 (Salk) Juan Carlos Izpisua Belmonte以及德克萨斯大学西南医学中心的吴军课题组以及深圳华大基因研究院合作在Science在线发表研究成果Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture；中国科学院动物研究所和中国科学院干细胞与再生医学创新研究院王红梅研究员、李磊研究员和中国科学院昆明动物研究所郑萍研究员合作在Science杂志上背靠背发表了另一项研究性长文In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation。

来自昆明理工大学等处的研究团队实现了食蟹猴胚胎体外20天的培养，培养胚胎呈现出了与体内发育胚胎高度一致形态学与基因表达特征。结合胚胎体外培养系统和单细胞多组学测序技术，研究团队在受精9天后对体外培养胚胎进行了测序。通过细胞谱系及分子轨迹变化分析，研究人员系统研究了上胚层细胞 (epiblast) 多能性动态变化过程，揭示了氧化磷酸化途径在naïve多能性维持中的作用；滋养层谱系的单细胞转录组数据显示了滋养层谱系的分化路径，并表明小鼠中公认的滋养层干细胞标记CDX2在灵长类早期胚胎发育中表达并不能维持，对灵长类滋养层发育提出了新的见解；研究结果同时揭示了灵长类着床后胚胎发育中不同细胞谱系间的互相作用，为进一步理解着床后胚胎发育微环境 (niche) 的重要作用提供了新的思路。更为重要的是，研究结果揭示了羊膜上皮是潜在的原始生殖细胞起源地，但是也不排除epiblast来源。尽管研究结果还需要进一步的验证，但对灵长类PGC的早期起源提供了新的见解。

而来自中科院北京动物所与中科院昆明动物所合作的研究中，研究人员借助该团队深耕多年建立的非人灵长类动物胚胎体外培养系统，同样能将食蟹猴囊胚体外培养至原肠运动出现，并进一步发育至受精后20天。从形态学、标记分子染色和单细胞转录组等多个角度提供了充分的证据，证明体外发育的食蟹猴胚胎高度重现体内胚胎发育，包括原肠运动在内的多个重要事件；第一次提供了灵长类动物早期胚胎发育过程中羊膜细胞的基因表达特征，并重新定义了多种灵长类动物早期胚胎细胞类型。

原肠运动（gastrulation）作为胚胎发育最重要事件之一，是一个古老而神秘的研究领域。早期的发育生物学家们对原肠运动的阐述各不相同，直到上世纪五六十年代，原肠运动才有了较为统一的定义，即“细胞经有序的迁移后分化形成三个胚层”。模式动物的应用对于人类认识原肠运动发挥了不可替代的重要作用。发育生物学家最初以结构简单的低等无脊椎动物，如海绵、水母、海胆、线虫和果蝇等研究原肠运动，揭示了该过程中细胞运动、细胞极化、细胞连接和细胞间通讯等基本细胞生物学事件；继而采用高等脊椎动物，如鱼类（斑马鱼）、两栖类（非洲爪蟾）和哺乳类（小鼠）等为模型探索原肠运动，原肠运动发生机制的神秘面纱被逐渐揭开。然而，上述模式动物与人类存在很大差异，即使同为哺乳动物的啮齿类，其早期胚胎也与灵长类动物存在显著不同，比如小鼠胚胎着床后上胚层形成杯状结构，而灵长类动物胚胎则形成双层胚盘状结构。因此，很难将小鼠有关原肠运动的研究结果直接推演到人类等灵长类动物。

总的来说，这两项背靠背主要由中国科学家完成的工作，以与人遗传与进化较为接近的食蟹猴作为模式动物，避免了人类胚胎培养14天的伦理限制，首次证明灵长类动物胚胎可以在没有母体支撑的情况下体外发育至原肠运动，并重现了灵长类动物早期胚胎发育的几个关键事件。本研究对探索灵长类动物早期胚胎发育和原肠运动开辟了崭新研究平台，为人类早期胚胎发育异常等重大疾病的临床药物研发和再生医学的发展提供了潜在的新工具，为人类深入认识胚胎发育机制和体外孕育生命（非人）探索提供了重要数据。

据悉，在第一篇论文中，昆明理工大学灵长类转化医学研究院谭韬课题组博士生孙念琴、硕士生李昌及华大基因雷莹博士为该文章的并列第一作者，美国salk研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte教授及昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授、季维智教授和谭韬教授为文章的共同通讯作者；在第二篇论文中，中科院动物研究所和昆明动物所联合培养博士生马怀孝（现为昆明动物研究所助理研究员）、中科院动物研究所和中科院干细胞与再生医学创新研究院博士生翟晶磊、助理研究员万海峰和博士后蒋祥祥为该论文的共同第一作者，王红梅研究员、李磊研究员和郑萍研究员为该论文的共同通讯作者。

原文链接：https://science.sciencemag.org/content/early/2019/10/31/science.aax7890；https://science.sciencemag.org/content/early/2019/10/31/science.aaw5754

专家点评 高绍荣（同济大学教授，生命科学与技术学院院长）

原肠运动是囊胚着床后的一个里程碑事件。原肠运动的正常、有序发生是三个胚层形成的基础，为后续各脏器正常分化提供保障。但由于原肠运动发生在囊胚植入母体子宫后，受到研究材料、实验技术和动物伦理等因素的限制，目前人们对原肠运动的认识依然十分有限。在哺乳类动物中，仅小鼠的原肠运动过程相对研究较多，而啮齿类和灵长类动物在胚胎早期的发育过程存在很多差异，两者不能完全进行类比。所以“灵长类动物胚胎原肠运动如何有序发生？”“我们将借助怎样的技术平台研究灵长类动物胚胎原肠运动？”对这两个问题的回答，将成为发育生物学领域的重要事件。最近两项研究通过体外培养猴胚胎至20天，为我们揭示了灵长类动物胚胎原肠运动的机制。

第一项研究来自昆明理工大学谭韬、季维智、牛昱宇研究团队实现了食蟹猴胚胎体外20天的培养，培养胚胎呈现出了与体内发育胚胎高度一致的形态学与基因表达特征。结合胚胎体外培养系统和单细胞多组学测序技术，研究团队在受精9天后对体外培养胚胎进行了测序，通过细胞谱系及分子轨迹变化分析，研究人员系统研究了上胚层细胞 (epiblast) 多能性动态变化过程，揭示了氧化磷酸化途径在naïve多能性维持中的作用；滋养层谱系的单细胞转录组数据显示了滋养层谱系的分化路径，并表明小鼠中公认的滋养层干细胞marker CDX2在灵长类早期胚胎发育中表达并不能维持，对灵长类滋养层发育提出了新的见解；研究结果同时揭示了灵长类着床后胚胎发育中不同细胞谱系间的相互作用，为进一步理解着床后胚胎发育微环境 (niche) 的重要作用提供了新的思路。 更为重要的是，研究结果揭示了羊膜上皮是潜在的原始生殖细胞起源地，但是也不排除epiblast来源。尽管还需要进一步深入细致的机制研究进行证实，但当前研究结果对灵长类PGC的早期起源提供了新的见解。

第二项研究来自中科院动物研究所王红梅、李磊和昆明动物所郑萍合作团队，研究以食蟹猴胚胎为研究对象，构建猴子胚胎体外长时程培养至20天的培养体系，并以此为基础研究灵长类胚胎原肠运动的发生过程。为评估这个体外系统是否能真实的模拟体内早期胚胎的发育，研究人员们从形态学、谱系标记分子染色和单细胞转录组等多个方面进行了验证。结果表明体外培养胚胎的系统能在体外重现很多重要的发育事件，比如：羊膜腔和卵黄囊的发育，双层胚盘结构的形成，原始生殖细胞的出现和原肠运动的起始等。这是首次在体外培养的胚胎上重现灵长类的原始生殖细胞和原肠运动，并且首次借助单细胞转录组测序技术解析灵长类早期胚胎发育过程中的羊膜细胞基因表达谱。这项工作对探索灵长类早期胚胎发育，特别是胚胎早期植入阶段和原肠运动阶段，开辟了一个崭新的研究平台。结合细胞示踪技术和单细胞测序技术，该体系将推动灵长类早期胚胎发育和疾病的研究，推动胚胎干细胞定向分化，以及再生医学等相关领域的发展。

专家点评 周帆、汤富酬（北京大学BIOPIC）

理解包括人类在内的灵长类的胚胎发育机制，即单细胞受精卵如何逐渐分化发育形成高度复杂但又高度协调有序的有机体，一直是生命科学领域的核心问题之一。原肠运动（gastrulation）是灵长类胚胎着床后发育的重要生物学事件。在此过程中，具有各自独特发育命运的三个胚层（外胚层、中胚层、和内胚层）逐渐形成，胚胎发育的基本框架和原初蓝图得以建立。由于材料获取等因素的严重制约，对于灵长类、特别是人类这一胚胎时期的研究基本处于空白状态。近年来，人类囊胚体外培养模拟着床体系为围着床时期发育阶段的研究提供了新工具。然而受限于国际通行的伦理学准则（人类胚胎体外培养原则上不能超过14天），目前对于原肠运动这一关键阶段的发育规律与潜在的调控机制知之甚少。近日有联合团队另辟蹊径，解决了这一问题：昆明理工大学灵长类转化医学研究院季维智教授、谭韬教授、牛昱宇教授与索尔克研究所的 Juan Carlos Izpisua Belmonte教授于10月31日联合在《Science》在线发表重要研究成果“Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture”；与此同时，《Science》同期在线发表了中国科学院动物研究所王红梅研究员、李磊研究员与中国科学院昆明动物研究所郑萍研究员共同合作的重要研究成果：“In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation”。

这两篇论文在国际上首次实现了食蟹猴/猕猴胚胎连续20天的体外培养，成功模拟了胚胎着床和原肠运动过程。研究者们结合长时间体外培养食蟹猴/猕猴胚胎的培养系统、形态学鉴定、以及单细胞组学测序等分析，证实了体外和体内发育胚胎在形态学与基因表达特征上高度相似，且均能在体外重现体内胚胎的多个重要生物学事件。此外，研究者还系统分析了早期羊膜和尿囊腔的形成过程，观察到细胞极性在早期胚胎不同腔体形成过程中具有潜在重要作用，并揭示了羊膜上皮是原始生殖细胞的来源之一。结合单细胞组学测序技术，研究者们还发现各类细胞谱系的动态发育过程以及不同谱系细胞之间复杂的分子互作关系，为灵长类胚胎着床过程中的谱系特化规律提供了新见解。这两项具有重大意义的研究开启了灵长类原肠运动研究新的大门，也是中国科学家对于灵长类早期胚胎发育领域的又一项重大贡献。

可以预期的是，随着对该培养体系的持续优化（例如新型三维培养体系的建立），未来有望使体外培养系统能高效支持胚胎发育到更晚期阶段（例如神经胚时期），在此基础上结合各类新技术（例如基因编辑和单细胞组学分析等），这一培养体系必将有助于逐步揭开灵长类胚胎发育调控的神秘面纱。

参考文献

1. T. Nakamura et al., A developmental coordinate of pluripotency among mice,monkeys and humans. Nature 537, 57-62 (2016).2. A.Deglincerti et al., Self-organizationof the in vitro attached human embryo. Nature533, 251-254 (2016).3. M.N. Shahbazi et al., Self-organizationof the human embryo in the absence of maternal tissues. Nat Cell Biol 18,700-708 (2016).4. F.Zhou et al., Reconstituting thetranscriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature 572, 660-664 (2019).